Микроскоп

Микроскоп — прибор для получения увеличенного изображения объектов или деталей их структуры, не видимых невооруженным глазом. Глаз способен различать детали объекта, отстоящие друг от друга не менее чем на 0,08 мм; с помощью светового М. можно видеть детали, расстояние между которыми составляет до 0,2 мкм: электронный М. позволяет получить разрешение до 0,1—0,01 нм. Способность систем из двух линз увеличивать изображение предметов была известна мастерам, изготовлявшим очки. О таких свойствах полушаровидных и плосковыпуклых линз жали оптики-ремесленники Нидерландов и Северной Италии в 16 в. Есть сведения, что приблизительно в 1590 г. прибор типа М. был построен Янсеном (Z. Jansen) в Нидерландах. Сначала появились простые М., состоящие из одного объектива, а затем были сконструированы более сложные М., имеющие, кроме объектива, и окуляр. Быстрое распространение и совершенствование М. началось после того, как Галилей (G. Galilei), совершенствуя сконструированную им зрительную трубу, стал использовать ее как своеобразный М. (1609—1610), изменяя расстояние между объективом и окуляром. Позднее, в 1624 г., добившись изготовления более короткофокусных линз, Галилей значительно уменьшил габариты своего микроскопа.

В 1625 г. членом Римской «Академии зорких» («Akudemia dei lincei») И. Фабером был предложен термин «микроскоп». Первые успехи, связанные с применением М. в научных биологических исследованиях, были достигнуты Гуком (R. Hooke), который первым описал растительную клетку (около 1665 г.). А. Левенгук (A. van Leenwenhoek) с помощью М. обнаружил и зарисовал сперматозоиды. различных простейших, детали строения костной ткани (1673—1677). В 1668 г. Е. Дивини, присоединив к окуляру полевую линзу, создал окуляр современного типа; в 1673 г. Гавелий ввел микрометрический винт, а Гертель предложил под столик микроскопа поместить зеркало. Таким образом, М. стали монтировать из тех основных деталей, которые входят в состав современного биологического М. В начале 18 в. М. появились в России; здесь Эйлер (Z. Euler) впервые разработал методы расчета оптических узлов микроскопа.

В 18 и 19 вв. М. продолжали совершенствоваться. В 1827 г. Амичи (G.В. Amici) впервые применил в М. иммерсионный объектив. В конце 18 — начале 19 в. была предложена конструкция и дан расчет ахроматических объективов для М., благодаря чему их оптические качества значительно улучшились, а увеличение объектов, обеспечиваемое таким М., возросло с 500 до 1000 раз. В 1850 г. английский оптик Сорби (Н.С. Sorby) сконструировал первый микроскоп для наблюдения объектов в поляризованном свете. В 1872—1873 гг. Аббе (Е. Abbe) разработал ставшую классической теорию образования изображений несамосветящихся объектов в М. Труды английского оптика Дж. Сиркса (1893) положили начало интерференционной микроскопии. В 1903 г. Р. Жигмонди (R. Zsigmondy) и Зидентопф (Н. Siedentopf) создали ультрамикроскоп, в 1911 г. Саньяком (М. Sagnac) был описан первый двухлучевой интерференционный М., в 1935 г. Зернике (F. Zernicke) предложил использовать метод фазового контраста для наблюдения в М. прозрачных, слабо рассеивающих свет объектов. В середине 20 в. был изобретен электронный микроскоп, в 1953 г. финским физиологом Вильской (A. Wilska) был изобретен аноптральный М. Большой вклад в разработку проблем теоретической и прикладной оптики, усовершенствование оптических систем М. и микроскопической техники внесли М.В. Ломоносов, И.П. Кулибин, Л.И. Мандельштам, Д.С. Рождественский, А.А. Лебедев, С.И. Вавилов, В.П. Линник, Д.Д. Максутов и др. Микроскоп является наиболее распространенным прибором для медицинских исследований в лабораторно-клинической и патологоанатомический практике, включая лаборатории поликлиник и амбулаторий (см. Микроскопические методы исследования).

Современный биологический микроскоп имеет массивный штатив (основание) с присоединенным к нему тубусодержателем, на котором смонтирована оптическая система, микромеханизм грубой и тонкой настройки оптической системы, головка для крепления револьверного устройства со сменными 3—4 объективами. предметный столик с конденсором и диафрагмой, и под ним светонаправляющее зеркало, концентрирующее естественный или искусственный свет на объект исследования. Тубусодержатель М. заканчивается головкой. на которой крепится монокулярный или бинокулярный тубус М. Предметный столик М. имеет приспособление для крепления предметного стекла с объектом исследования и механизм его перемещения в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Движение препарата в обоих направлениях можно определить по нониусам (вспомогательным шкалам), имеющим цену деления 0,1 мм. Конденсор М. представляет собой короткофокусный объектив, ирис-диафрагму и светофильтр. Конденсоры применяют для различных методов микроскопического исследования. например. для микроскопии в проходящем свете применяют конденсоры светлого или темного поля; причем конденсор светлого поля рассчитан на проходящее освещение препарата, а конденсор темного поля — на освещение препарата полым световым конусом. Чтобы луч света не мешал наблюдателю, пользуются конденсорами, создающими косое световое поле (под углом к оптической оси микроскопа), а также конденсоры для фазово-контрастных исследований, конденсоры отраженного света (эпиконденсор), представляющие собой кольцеобразную зеркальную или зеркально-линзовую систему вокруг объектива. Объективы современных М. — сложные оптические системы, с помощью которых получают изображение исследуемого объекта почти без аберрации (т.е. отчетливое без искажения); они позволяют достигать разного увеличения объекта и дают обратное (перевернутое) изображение.

Объектив состоит из нескольких линз. Чем больше увеличение, тем ближе к препарату должен располагаться объектив, т.е. тем меньше его фокусное расстояние. Каждый объектив характеризуется силой увеличения (указана на его оправе: *10, *20, *40, *90). фокусным расстоянием, апертурой (действующее отверстие оптического прибора, определяемое размером линз и регулируемое ирис-диафрагмой), светосилой. Наиболее простые объективы, у которых хроматическая аберрация сведена к остаточной окраске изображения (ореолу), называют ахроматическими. Полуахроматическими именуют объективы, у которых в значительно большей мере устранена хроматическая аберрация; их линзы изготавливают из флюоритового стекла. Планахроматические и планапохроматические объективы почти полностью устраняют кривизну изображения объекта и хроматическую аберрацию, возникающую при разложении белого света на спектральные составляющие вследствие различного преломления лучей спектра. Объективы, обеспечивающие значительное увеличение с малым фокусным расстоянием, численная величина апертуры которых выше 0,95, называются иммерсионными. Их используют в среде с более высоким показателем преломления. чем воздух (вода, глицерин, специальное иммерсионное масло). Каплю одного из указанных веществ наносят на предметное стекло препарата и погружают в нее объектив.

Обратное изображение, получаемое объективом, рассматривают через окуляр с увеличением (обозначено на оправе) ?5; ?10; ?15 и т. д. Окуляр представляет собой систему линз (чаще двух), взятых в обойму; его вставляют в зрительную трубу М. или его бинокулярной насадки. Наиболее распространены окуляр Гюйгенса главным образом для ахроматических и планахроматических объективов и окуляр Рамсдена для большинства объективов. Кроме того, существуют специальные компенсационные окуляры с увеличением до ?20, предназначенные для исправления остаточных хроматических аберраций объектива. Общее увеличение М. определяется как произведение увеличения объектива и увеличения окуляра; оно достигает 1500—2000. Помимо просмотровых окуляров существуют фотоокуляры и проекционные окуляры, предназначенные для фотографирования изображения или его проецирования на экран. Для измерения размеров исследуемого объекта применяются специальные окуляр-микрометры, в которые вмонтирована масштабная сетка с делениями. Для нормальной работы с М. необходимо достаточное освещение объекта исследования, что достигается с помощью различных осветителей. Они имеют мощные источники света, работающие непосредственно от электрической сета или через понижающий трансформатор. В сложных М. для исследовательских работ (МБИ-6, МБИ-15 и др.) осветитель встроен в систему М.

Наиболее часто употребляемые осветители для работы в проходящем свете — ОС-14, ОИ-9М, ОИ-24 и более мощные — ОИ-19, ОИ-25, дающие значительно больший световой поток, применяются для темнопольной и фазово-контрастной микроскопии. Для люминесцентного анализа используют осветитель ОИ-24, создающий УФ-излучение; при применении светофильтра его используют для фотографирования объектов исследования. Отечественная промышленность, кроме М. для биологических исследований, выпускает стереомикроскопы (БМ-56, МБС-1, МБС-2, МБС-З и пр.), обеспечивающие исследование объекта под разными углами зрения; при этом создается стереоскопический эффект, и наблюдаемое изображение воспринимается объемно. Микроскопы сравнения обеспечивают визуальное сопоставление двух препаратов. Изображение каждого занимает половину поля зрения М., что позволяет проводить сравнительное изучение объектов. Контактные М. дают возможность проводить прижизненные исследования микроскопических структур отдельных участков тканей путем прижатия объектива к объекту исследования. Освещение объекта осуществляется через объектив обычно коротковолновой частью светового излучения с применением опак-иллюминатора с интерференционным светоделителем. Темнопольный М. предназначен для рассматривания объектов при освещении препарата лишь по краям темнопольным конденсором; при этом структуры, находящиеся внутри светового конуса, отражают свет и становятся видимыми на темном поле.

Фазово-контрастный М. (аноптральный М.) служит для исследования прозрачных объектов, которые не видны на светлом поле и не подлежат окрашиванию из-за возникновения аномалий в исследуемых образцах. Этот М. широко применяется при исследовании микробных клеток, микроскопическом анализе мочи, онкологических препаратов тканей и т.д. Конденсор фазово-контрастного микроскопа (КФ-4) имеет апертурную диафрагму в виде кольца и фокусирующее световое кольцо, ослабляющее световой поток и изменяющее фазу на четверть волны; при этом невидимые структуры препарата становятся контрастными, хорошо видимыми. Интерференционный М. дает возможность исследовать объекты с низкими показателями преломления света и чрезвычайно малой толщины. В отличие от фазово-контрастного устройства в интерференционном М. луч света, входящий в М., раздваивается. Часть проходит через исследуемый объект, а другая мимо по той же или дополнительной оптической ветви; в жулярной части оба луча соединяются и интерферируются, что позволяет контрастировать и увидеть исследуемую структуру. Ультрафиолетовый и инфракрасный М. предназначены для исследования объектов в ультрафиолетовом или инфракрасном участке светового спектра. Они снабжены флюоресцентными экраном, на котором формируется изображение исследуемого препарата, фотокамерой с чувствительным к этим излучениям фотоматериалом или электронно-оптическим преобразователем для формирования изображения на экране осциллоскопа.

Длина волны ультрафиолетовой части спектра составляет 400—250 нм, поэтому в ультрафиолетовом М. можно получить более высокое разрешение, чем в световом М., где освещение осуществляется видимым световым излучением с длиной волны 700—400 нм. Преимуществом этого М. является также то, что невидимые в обычном световом М. объекты становятся видимыми, поскольку поглощают УФ-излучение. Ультрафиолетовые М. (МУФ-5, МУФ-6) используются при гистохимических исследованиях. В инфракрасном М. наблюдение объектов ведется на экране электронно-оптического преобразователя или фотографируется. С помощью инфракрасной микроскопии изучают внутреннюю структуру непрозрачных объектов. Поляризационный микроскоп (МИН-8 и др.) позволяет выявлять неоднородности (анизотропию) структуры при изучении строения тканей и образований в организме в поляризованном свете. Освещение препарата в поляризационном М. осуществляется через поляризатор-пластинку, которая обеспечивает прохождение света в определенной плоскости распространения волн. Когда поляризованный свет, взаимодействуя со структурами, изменяется, то структуры резко контрастируют, что широко используют в медико-биологических исследованиях при изучении препаратов крови, гистологических препаратов, шлифов зубов, костей и т. д. Люминесцентный микроскоп (МЛ-2, МЛ-3) предназначен для исследования люминесцирующих объектов, что достигается при освещении последних с помощью УФ-излучения. Наблюдая или фотографируя препараты в свете их видимой возбужденной флюоресценции (т. е. в отраженном свете), можно судить о структуре исследуемого образца, что используется в гистохимии, гистологии, микробиологии и при иммунологических исследованиях. Прямое окрашивание люминесцентными красителями позволяет более четко выявлять такие структуры клеток, которые трудно рассмотреть в световом М.

Для определения интенсивности видимой флюоресценции служит фотометрическая насадка (ФМЭЛ-1) для люминесцентных микроскопов. Рентгеновский М. используется для исследования объектов в рентгеновском излучении, поэтому такие М. снабжены микрофокусным рентгеновским источником излучения, преобразователем рентгеновского изображения в видимое — электронно-оптическим преобразователем, формирующим видимое изображение на осциллографической трубке или на фотопленке. Рентгеновские М. имеют линейное разрешение до 0,1 мкм, что позволяет исследовать тонкие структуры живого вещества. Сканирующий М. дает возможность осуществлять последовательный осмотр препарата на выбранном участке построчно; расстояние между каждой просматриваемой строчкой устанавливается исследователем. М. снабжен устройством, обеспечивающим передвижение препарата в автоматическим режиме и фотометрирование или какой-либо другой метод оценки отмечаемых структурных изменений в исследуемом образце. М. применяют при изучении гистологических препаратов, мазков крови, клеточных структур, например хромосомного набора. Осциллографическая трубка М. имеет выход на экран. Существуют также специальные телевизионные микроскопы.

Ультрамикроскоп позволяет наблюдать объекты, размеры которых за пределами разрешающей способности наиболее сильных объективов световых М. Он имеет боковое освещение объекта исследования на фоне темного поля. Освещенные частицы, рассеивая свет, наблюдаются в виде ярких точек, что используется для изучения движения мелких частиц, чаще всего в проточной кювете. Операционный М. используется для проведения микрохирургических операций в офтальмологии, оториноларингологии, нейрохирургии и других областях микрохирургии. В отечественном операционном микроскопе ОМ-2 предусмотрено 4-; 6,3-; 10-; 16-; 25-кратное увеличение, что соответствует полям зрения 45; 29; 18; 11,3; 7,2 мм в диаметре. Изменение увеличения может быть также плавным. Рабочее расстояние микроскопа — 195,2 мм, что позволяет хирургу свободно манипулировать при операциях. Предусмотрены возможность регулирования бинокулярных окуляров в пределах ±5 дптр, и их установка по глазу хирурга. М. имеет волоконнооптическую систему освещения операционного поля, демонстрационное визуальное устройство, фотоприставку, возможно подключение к нему киноаппаратуры для съемки операции и телевизионного наблюдения. Операционный М. крепится на массивном штативе с помощью поворотно-подъемного многопозиционного реечного механизма. Все оптические М. требуют бережного обращения, т. к. являются точно юстированными оптическими системами.

К оптическим поверхностям М. нельзя прикасаться руками; пыль снимают мягкой кисточкой, а оптические поверхности протирают смоченными в этиловом спирте батистовыми салфетками. Хранение М. и осветителей, работа с ними производятся при комнатной температуре и влажности воздуха, не превышающей 60%, при отсутствии паров, вызывающих коррозию. Электронный М. предназначен для исследования сверхтонких структур, неразличимых в световых М. В отличие от светового М. в электронном М. разрешение определяется не только явлениями дифракции, но и различными аберрациями электронных линз, которые практически невозможно корригировать. Наводка М. в основном производится диафрагмированием за счет применения малых апертур электронных пучков. В зависимости от применяемых линз различают магнитные, электростатические или комбинированные электронные М. По характеру исследования выделяют просвечивающие, отражательные, эмиссионные, растровые, теневые и зеркальные электронные М. Наиболее распространены М. просвечивающего типа, что связано с их наиболее высокой разрешающей способностью по сравнению с другими типами микроскопов. В просвечивающем электронном М. пучок электронов проходит через объект и попадает в линзу, которая создает первое электронное промежуточное изображение. Это изображение можно наблюдать на флюоресцирующем экране.

Пучок электронов, несущий информацию об исследуемом объекте, проходя через отверстие в центре экрана, попадает на проекционную линзу, которая создает второе увеличение на втором экране. Полученное изображение можно фотографировать встроенным фотоаппаратом. В отражательном электронном М. изображение объекта видится в отраженных от него электронных лучах, что позволяет непосредственно изучать поверхность объектов. В эмиссионном электронном М. изображение объекта формируется с помощью имитируемых им электронов. В растровом М. изображение формируется на кинескопе, а в теневом — создается увеличенное теневое изображение объекта на удаленном экране или фотопленке. В зеркальном электронном М. основой является электронное зеркало, отражающее электроны от эквипотенциальной поверхности исследуемого объекта (все ее точки имеют один и тот же потенциал) для последующего формирования изображения. Преимущества такого способа получения изображения заключаются в том, что объект практически не облучается электронами или облучается электронами слабых энергий, почти не повреждающих биологические объекты. С развитием лазерной техники в практику исследований, например при изучении динамических процессов движущейся крови, вошли голографические М., обеспечивающие получение объемного изображения микроструктур. В таких М. источником освещения объекта служит монохроматическое излучение, генерируемое лазерным источником. Интерпретация подобных исследований и управление ими возможны только с использованием ЭВМ.

Библиогр.: Воронин В.В. Основы теории микроскопа, Тбилиси, 1965; Панов В.А. и Андреев Л.Н. Оптика микроскопов, Л., 1976.