Микробиологическая диагностика

Микробиологическая диагностика — основана на идентификации возбудителя или выявлении иммунного ответа организма больного на него. Начальным этапом М.д. является отбор материала и транспортировка проб в лабораторию. Вид материала для исследования определяется особенностями заболевания. Существует несколько общих условий его взятия. Пробы берут до начала антибактериальной терапии или после выведения антибактериального препарата из организма. Если исследование необходимо провести в период лечения, то при посеве материала в него добавляют ингибитор препарата (например, пенициллиназу в случае применения бета-лактамного антибиотика). При взятии материала соблюдают правила асептики. Количество материала должно быть достаточным для проведения анализа. Материал, полученный от больных с хроническими вялотекущими инфекционными процессами, содержит меньше микроорганизмов, чем при остром процессе. поэтому для выделения возбудителя требуется большее его количество.

Образцы материала собирают в стерильную посуду, которую маркируют, помещают в специальные биксы или пеналы и направляют в лабораторию. В сопроводительном документе (направлении) приводят сведения о характере материала, времени его взятия, данные о больном, включающие предполагаемый клинический диагноз и перечисление антибиотиков, использованных в лечении, указывают название учреждения, отделения, направляющего материал. Транспортировку материала для исследования осуществляют в предельно сжатые сроки. Охлаждение материала в холодильнике при t° 4° (или на льду) позволяет увеличить время до начала исследования на 30—60 мин. Более длительное хранение может привести к гибели возбудителей или изменению количественных соотношений частей микрофлоры. Поэтому в случаях, когда хранение и транспортировка длятся более суток, используют консервант или транспортные (поддерживающие, накопительные) среды и специальные средства, сохраняющие жизнедеятельность микроорганизмов. Так, для транспортировки образцов материала. предназначенных для выделения анаэробных бактерий, применяют герметизированные флаконы или пробирки, заполненные бескислородным газом. Риккетсии, хламидии и вирусы выделяют в специализированных лабораториях или крупных диагностических центрах, куда материал направляют в хорошо закрытых контейнерах в замороженном состоянии (сухой лед). В некоторых случаях посев необходимо производить ex tempore (при коклюше, менингококковой инфекции, дизентерии). Методы, позволяющие провести посев материала у постели больного, значительно повышают вероятность выделения возбудителя.

Микроскопия микроорганизмов (см. Микроскопические методы исследования) широко применяется в М.д. Так, микроскопию бактерий (бактериоскопию) проводят при анализе исходного материала от больного, а также после выращивания возбудителей на жидких или твердых питательных средах и визуального изучения особенностей выросших колоний. Препараты для бактериоскопии (окрашенные или нативные) готовят в момент взятия проб или сразу после поступления их в лабораторию. При некоторых заболеваниях, например, возбудители могут быть обнаружены с помощью бактериоскопии в первый день болезни. Для выявления возбудителей малярии исследуют препарат толстой капли крови, для приготовления которого большую каплю крови больного помещают на предметное стекло, распределяют круговыми движениями до получения мазка диаметром 1—1,5 см и высушивают. Нефиксированный препарат окрашивают по методу Романовского — Гимзы. В сравнении с тонким мазком толстая капля позволяет исследовать больший объем крови, что повышает вероятность обнаружения возбудителей. Наиболее распространенным методом окраски препаратов для бактериоскопии является метод Грама и его модификации. С помощью метода бактерии подразделяют на две группы: грамположительные, окрашенные в сине-фиолетовый цвет, и грамотрицательные, имеющие розовый или красный цвет. Для уточнения сомнительных результатов окрашивания по Граму используют дополнительные методы.

Нахождение в мазках грамположительных кокков (типа ланцетовидных диплококков). окруженных зоной не окрасившейся капсулы. может свидетельствовать о наличии пневмококков. Если обнаруживают грамположительные кокки, расположенные цепочкой, то предполагают, что в исследуемом материале содержатся стрептококки. Расположение грамположительных кокков в виде гроздей винограда может указывать на присутствие стафилококков. Выявление мелких грамотрицательных палочек кокковидной формы позволяет предположить наличие гемофильных бактерий. Грамотрицательные палочки различной величины, окруженные капсулой в виде светлого ореола. характерны для клебсиелл, а бескапсульные палочки — для синегнойной палочки, эшерихий, протеев и других энтеробактерий. При обнаружении в мазках грамположительных длинных палочек предполагают наличие споровых анаэробов или аэробов. Другое важное тинкториальное свойство бактерий (отношение к окраске) связано с тем, что не которые кислотоспиртоустойчивые бактерии не обесцвечиваются смесью кислоты со спиртом после окрашивания горячим раствором карболового фуксина Циля. Это свойство выявляется при окраске по методу Циля — Нельсена микобактерии туберкулеза и отдельных родственных им бактерий, а также некоторых актиномицет и спор бактерий, которые окрашиваются в красный цвет. а остальные элементы мазка — в синий. Микроскопия (главным образом фазово-контрастная) микроорганизмов в нативном состоянии имеет ограниченное применение, главным образом при выявлении их подвижности, изучении морфологии микроорганизмов, лишенных клеточной стенки (микоплазм и L-форм бактерий).

Для приготовления препаратов живых микробных клеток используют суспензии культур микроорганизмов. выращенных в жидких и на плотных питательных средах. Препарат раздавленная капля готовят путем нанесения 0,05—0,1 мл суспензии на чистую обезжиренную поверхность предметного стекла, затем его накрывают покровным стеклом, а каплю суспензии раздавливают. В отличие от этого при приготовлении препарата висячая капля суспензию помещают в центре покровного стекла, которое затем переворачивают и устанавливают над лункой, располагающейся в центре предметного стекла, таким образом, что капля остается висеть на покровном. Микроскопия микроорганизмов позволяет выявлять форму, морфологические особенности микробных клеток, их подвижность, что дает возможность без постановки дополнительных тестов составить представление о возбудителе и приступить к бактериологическим методам исследования. Основными этапами бактериологических методов исследования являются посев материала на питательные среды, выделение чистой культуры (популяции микроорганизмов одного вида), идентификация и дифференциация выделенных культур, определение чувствительности изолированных микроорганизмов к антибиотикам и антисептикам. Используемые для посева среды разнообразны по составу, консистенции (жидкие, полужидкие и плотные) и функциональному предназначению. В зависимости от цели бактериологического исследования, а также на основании результатов бактериоскопии, изучения эпидемической ситуации (т.е. предполагаемой видовой принадлежности микробов) осуществляют выбор одной или нескольких питательных сред для посева.

Изучение особенностей роста микроорганизмов на средах после инкубирования в термостате позволяет судить об их культуральных свойствах. При росте в жидких средах отмечают степень ее прозрачности, наличие осадка или пленки на поверхности среды. При изучении колоний на плотных питательных средах обращают внимание на их размер, прозрачность, форму, особенности очертаний, плотность, консистенцию, наличие пигмента, специфического запаха, гемолиза и т.д. Выделению чистых культур возбудителей способствует использование элективных и селективных сред (обеспечивающих избирательный рост определенных видов микроорганизмов). Посев материала для исследования на дифференциально-диагностические среды (содержат как вещества, угнетающие рост посторонней микрофлоры, так и субстраты для выявления отдельных ферментов) позволяет оценить чистоту культуры возбудителей, сопоставить относительную численность колоний каждого типа по цвету колоний на питательной среде в результате изменения индикатора. Так, дифференцирующим субстратом в средах Эндо, Плоскирева, Мак-Конки является лактоза, по отношению к которой отличают бесцветные колонии бактерий, не ферментирующие этот углевод (шигеллы, сальмонеллы и др.), от окрашенных колоний, обладающих этой способностью (большинство энтеробактерий). На основании изучения культуральных свойств микроорганизмов определяют, к какой из систематических групп относится полученная чистая культура возбудителя, что важно для идентификации возбудителя. В зависимости от клинической и эпидемиологической потребностей уровень проводимой идентификации может быть различным. Чаще всего идентифицируют род и вид выделенной культуры возбудителя, исследуя при этом преимущественно ее биохимическую активность.

В ряде случаев М.д. включает в число своих задач идентификацию до уровня отдельных штаммов, т.е. проведение дифференциации и маркировки вариантов одного вида микроорганизма, что особенно важно при выявлении источника заражения и путей распространения возбудителей. При этом помимо исследования биохимических особенностей штамма проводят типирование с помощью типовых сывороток, бактериофагов, и бактериоцинов (колицинов, пиоцинов и др.), определяют антибиотико-граммы (показатели чувствительности микроорганизмов к антибиотикам) и т.д. Антибиотикограммы из-за изменчивости микроорганизмов в процессе лечения ограниченно используют для идентификации микроорганизмов и эпидемиологической маркировки штаммов. Однако определение антибиотикограммы является основным этапом М.д., обеспечивающим выбор оптимального препарата для антибактериальной терапии. Ведущим методом определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является дискодиффузионный метод, отличающийся простотой выполнения и экономичностью. Метод основан на измерении диаметра зон задержки роста испытываемого микроорганизма вокруг диска с антибиотиком. Наиболее точными в количественном отношении являются методы последовательных (серийных) разведений антибиотиков в жидкой или плотной питательной среде. Мерой чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам при использовании этих методов служит минимальная подавляющая концентрация (МПК) — наименьшая концентрация антибиотика, которая подавляет развитие штамма бактерий при стандартных условиях постановки опыта и выражается в абсолютных единицах действия (мкг/мл).

Знание минимальной подавляющей концентрации позволяет на основании сопоставления цифровых значений степени чувствительности клинических штаммов бактерий со средними концентрациями антибактериального препарата в организме выбрать оптимальный препарат. Чувствительными к химиотерапевтическому препарату считаются те микроорганизмы, на которые он оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие в концентрации, близкой к концентрации, достигаемой в очаге инфекции. Критерии чувствительности микроорганизмов к антибиотикам зависят не только от микроорганизмов, но и от концентрации антимикробного препарата в патологическом очаге, его фармакокинетических и фармакодинамических свойств (величины максимальной терапевтической дозы, токсичности и т.д.). При отношении минимальной подавляющей концентрации препарата к концентрации препарата в очаге поражения в случае введения терапевтической дозы менее единицы микроорганизмы расцениваются как чувствительные, а при отношении, равном единице или более, микроорганизмы относят к устойчивым. Для достижения терапевтического эффекта необходимо создание в крови концентрации препарата, примерно в 4—8 раз превышающей минимальную подавляющую концентрацию.

Поскольку уровень концентрации препаратов в очагах варьирует у больных в широких пределах, один и тот же возбудитель может быть одновременно охарактеризован как чувствительный и как устойчивый для одного и того же больного. Одной из задач М.д. является оценка сочетанного воздействия препаратов на выделенную культуру возбудителя. Для подбора эффективных комбинаций антибактериальных препаратов в лабораторной практике пользуются качественным дискодиффузионным методом. При этом диски, пропитанные антибиотиками, наносят на чашки Петри, засеянные исследуемой культурой возбудителя, на расстоянии равном или несколько большем, чем сумма радиусов зон подавления его роста. Эффект может быть разнообразным: индифферентным (независимым), если после инкубации имеются две независимые зоны подавления роста возбудителя вокруг каждого из дисков; синергидным (потенцированным) или аддитивным (суммарным) при слиянии зон подавления роста: антагонистическим, когда зоны подавления роста уменьшаются в части, обращенной друг к другу. Применяют также диски, пропитанные одновременно двумя препаратами. При этом для сравнения зон подавления роста возбудителя одновременно используют диски, содержащие по одному из данных препаратов. Если зона вокруг двойного диска больше, то говорят об аддитивном или синергидном эффекте, если меньше — об антагонизме. Определение антимикробной активности биологических жидкостей организма (сыворотки крови, мочи, желчи, цереброспинальной жидкости, различных экссудатов и др.) проводят до и после введения химиотерапевтического препарата, что позволяет получать более надежные данные о его терапевтических возможностях в условиях, приближенных к естественным. Так, задержка развития возбудителя в моче или желчи (при разведении в 4—8 раз), полученных от больного спустя 2—4 ч после начала терапии, указывает на эффективность химиотерапевтического препарата. Биологический метод (метод биологических проб) используется в М.д. для обнаружения возбудителя в организме больного, выделения культуры возбудителя и определения его патогенности. Биологический метод основан на заражении восприимчивых лабораторных животных исследуемым материалом (кровь, выделения больного) или чистой культурой возбудителя. Его применяют при зоонозных инфекциях (чуме, туляремии и др.). а также для обнаружения токсинов возбудителей.

Чаще пробы ставят на белых крысах, мышах, морских свинках и кроликах. Заражение в зависимости от целей постановки биологической пробы производят перорально, интраназально, внутривенно, накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно и субдурально. В диагностике инфекционных болезней используют реакции иммунитета, которые в зависимости от принципа используемого метода делят на две группы: по известным антителам определяют неизвестный антиген (возбудитель); по известным антигенам выявляют неизвестные антитела в сыворотке крови. При многих инфекциях соответствующие антитела появляются, как только возбудители начинают размножаться в организме, и сохраняются несколько месяцев или лет. Выявление антител не всегда связано с текущим заболеванием, а может указывать на контакт с возбудителем в прошлом. Поэтому к более перспективным относят методы, основанные на обнаружении в ранней стадии болезни микробных антигенов в сыворотке крови. Определение антител из-за анамнестических, прививочных и перекрестных реакций лишь относительно достоверно и в лабораторной практике имеет вспомогательное значение. Кожные тесты (выявление повышенной реактивности кожи при антигенном раздражении) также могут быть положительны не только при наличии инфекции, но и указывать на то, что организм был инфицирован в прошлом.

Реакцию кожи может подавлять ряд заболеваний, гормональная и иммунодепрессивная терапия, что в свою очередь, приводит к ложноотрицательным результатам тестирования. Заключительным этапом М.д. является составление ответа (заключения), который дает бактериологическая лаборатория по окончании анализа. Ответ содержит информацию, необходимую для установления клинического диагноза и назначения рационального лечения: перечень всех видов микроорганизмов, выделенных из исследуемого материала, их количественное содержание, чувствительность к антибактериальным препаратам каждой культуры микроорганизма, при необходимости отмечают особые характеристики и свойства выделенной микрофлоры, дают рекомендации по проведению дальнейших и дополнительных исследований. Микробиологическая диагностика при гнойно-воспалительных заболеваниях включает широкий и разнообразный комплекс исследований, что обусловлено необходимостью выделения и идентификации всех культур микроорганизмов, присутствующих в образце материала, в т.ч. представителей нормальной микрофлоры человека. Важным аспектом современной М.д. остается оценка этиологической значимости выделенных из материала условно-патогенных микроорганизмов.

Первичная клиническая диагностика таких инфекций осложнена тем, что разнообразные по таксономическому происхождению условно-патогенные микроорганизмы способны вызывать сходные комплексы общих и местных поражений. С другой стороны, один и тот же вид возбудителя может обусловливать многообразные по локализации, тяжести и клиническим проявлениям патологического изменения. При этом интерпретация результатов М.д. зависит от многих клинических и лабораторных показателей. Так, если микроорганизм изолирован из пробы материала, который в норме стерилен (кровь, цереброспинальная жидкость), то он рассматривается как возбудитель заболевания. хотя существует ряд исключений (например, транзиторная бактериемия). В этих случаях на наличие инфекции могут указывать отклонения от нормы результатов клинических анализов — лейкоцитоз, нарастающая анемия, сдвиг лейкоцитарной формулы влево до палочкоядерных нейтрофильных гранулоцитов, повышение концентрации С-реактивного белка и т.д. Когда исследуемый материал (фекалии, мокрота, отделяемое кожи и др.) содержит микроорганизмы, характерные для нормального состояния организма, учитывают качественные и количественные изменения, происходящие в составе микрофлоры, появление нетипичной микрофлоры для данной системы органов или на несвойственном анатомическом участке (нарушение естественного биотопа), повторность ее выделения и т.д. Поскольку начало развития инфекционного процесса сопряжено с колонизацией возбудителя и достижением им определенного критического числа (количество клеток микроорганизма, свидетельствующее о развитии инфекции), его количественное содержание в тканях или биологических жидкостях многократно выше, чем сопутствующей микрофлоры.

При многих инфекционных болезнях лаборатория сообщает окончательный ответ через 2—4 дня, а при туберкулезе, бруцеллезе — через 3—4 нед. Возросшая потребность в оптимизации труда клинико-микробиологических лабораторий и сокращении сроков получения результатов стимулировала разработку экспресс-методов, позволяющих регистрировать результаты через 3—6 ч, то есть в день проведения исследования. а не на следующие сутки, что чрезвычайно важно в экстренных клинических ситуациях. Новые системы и методы микробиологического анализа менее трудоемки и более экономичны, что имеет большое значение при массовых обследованиях с целью выявления скрытых инфекций. Их развитие идет по пути миниатюризации и автоматизации (компьютеризации) исследований, при этом для регистрации жизнедеятельности бактерий используют разнообразные принципы: фотометрический, кондуктометрический, радиометрический, биолюминесцентный, газохроматографический, колориметрический и многие другие. Наиболее разработаны методы регистрации оптической плотности или электропроводности жидкой питательной среды в процессе роста бактерий. Данные М.д. необходимы и широко используются в решении задач клинической медицины, эпидемиологии, больничной гигиены. Они помогают при расшифровке механизмов патогенеза заболеваний, вызванных микроорганизмами, роль которых в инфекционном процессе неизвестна или еще недостаточно ясна. Очень важны результаты М.д. для эпидемиологической оценки циркуляции возбудителей, проведения активного эпидемиологического надзора за динамикой развития и распространения лекарственной устойчивости микроорганизмов. См. также Вирусы, Грибки паразитические.

Библиогр.: Лабораторные методы исследования в клинике, под ред. В.В. Меньшикова, с. 312. М., 1987; Навашин С.М. и Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М., 1982; Энтеробактерии, под ред. В. И Покровского, с. 16, 246, М., 1985.